大知闲闲:脓毒症患者白蛋白和纤维蛋白原动力学:一项前瞻性观察研究

 

翻译:武汉大学中南医院 秦爱华

校译:北京协和医院 陈焕

 

摘要

 

背景:循环底物浓度的测量不能提供有关底物动力学的信息。因此,重症疾病过程中,血浆白蛋白浓度的降低是由于肝脏产生抑制还是外周清除率增加所致目前尚不清楚。在这项研究中,我们使用稳定同位素示踪剂输注,测量了脓毒症患者和非脓毒症患者对照组的白蛋白和纤维蛋白原动力学。

 

方法:经机构研究伦理委员会批准,征得患者或其授权委托人的书面知情同意后,纳入脓毒症机械通气的患者和择期冠状动脉旁路移植术的患者。非脓毒症组患者在手术前一天进行研究。用稳定同位素L-[环-2H5]苯丙氨酸测定白蛋白和纤维蛋白原的绝对合成速率(absolute synthesis rates,ASR)。首先予以负荷量L-[环-2H5]苯丙氨酸4µmol/kg,然后以0.15µmol/kg/min的速率输注6h。在基线和此后每小时抽血,用气相色谱/质谱法测定同位素丰度。极低密度脂蛋白载脂蛋白-B 100同位素富集被用来代表肝脏合成蛋白质的苯丙氨酸前体池的同位素富集。同时测定血浆白蛋白和纤维蛋白原浓度。

 

结果:脓毒症患者的平均血浆白蛋白低于非脓毒症患者,而合成率与非脓毒症患者相当。脓毒症患者与非脓毒症患者相比,平均血浆纤维蛋白原和ASR升高。在非脓毒症患者中,血浆白蛋白与ASR无显著相关性,但血浆纤维蛋白原与ASR显著相关。脓毒症患者血浆白蛋白和纤维蛋白原与ASR显著相关。

 

结论:脓毒症患者血浆白蛋白水平低于非脓毒症患者,但两组白蛋白合成相似,提示脓毒症时低蛋白血症不是由于肝脏生成受到抑制所致,而是循环清除率增强所致。脓毒症患者的高纤维蛋白原血症是纤维蛋白原产生增加的结果。

 

关键词:白蛋白,纤维蛋白原,稳定同位素示踪剂,脓毒症

 

背景.01

 

血浆转运蛋白-白蛋白(Plasma transport protein albumin)的测定传统上被用来监测人类的蛋白质和能量缺乏。虽然血浆白蛋白浓度可能不会检测到营养状态短期内的变化,它是慢性蛋白质-卡路里营养不良的一致标志。白蛋白是人类体内含量最丰富的血浆蛋白,其半衰期为17-19天。血管内白蛋白约占全身白蛋白总量的30-40%,其余的则存在于血管外池,即皮肤、肌肉、肠道、肝脏和皮下组织。白蛋白在体液分布和酸碱生理中也起着重要的调节作用。低蛋白血症可能是由于肝功能受损和/或营养蛋白-能量供应不足而导致合成减少所致。它也可能是血管外溢或通过肾脏排泄增强的结果。

 

纤维蛋白原是一种所谓的正急性时相蛋白,即它的血液水平在全身炎症、组织损伤和各种癌症时升高。纤维蛋白原水平升高被认为是血栓形成和血管损伤的原因,也就是有时与这些情况相关的并发症。

 

循环底物浓度的测量不能提供有关底物动力学潜在变化的信息。因此,目前尚不清楚,重症疾病期间出现的血浆白蛋白减少是由于生产受到抑制还是损失增加所致。事实上,根据之前的研究结果,在患有炎症、脓毒症、头部损伤或烧伤的患者中,白蛋白合成率已经显示出增加。

 

由于目前还没有关于重症患者白蛋白和纤维蛋白原动力学的全面研究,我们测量了脓毒症患者和对照组这两种蛋白的合成率。

 

方法.02

 

脓毒症患者的数据来自于2017年3月至2019年6月在加拿大魁北克省蒙特利尔的皇家维多利亚医院(McGill University Health Centre MUHC)进行的一项关于脓毒症期间蛋白质摄入对合成代谢影响的随机对照试验(ClinicalTrials.gov NCT02865408)。

 

非脓毒症患者的数据来自一项关于开胸心脏手术术后氨基酸含量增加对蛋白质平衡的影响的随机对照试验(ClinicalTrials.gov NCT02549443)。这项研究的结果,除了白蛋白动力学,发表在2016年。

 

经机构研究伦理委员会批准,在获得患者或其授权委托人的书面知情同意后,纳入脓毒症机械通气的患者(脓毒症组)和择期冠状动脉旁路移植术的患者(非脓毒症组)。

 

脓毒症被定义为继发于感染的SOFA评分≥2分的急性变化。因此,患者是在脓毒症急性期入选的。接受体外膜氧合或二氧化碳清除、接受肾脏替代治疗、有肝功能障碍迹象以及器官移植后的垂死状态的患者被排除在外。在入住ICU时计算临床评分,包括APACHEII评分用于评估疾病的严重程度。

 

心脏病患者在手术前一天进行研究,脓毒症患者在获得同意并登记后一天进行研究。排除严重营养不良(前3个月体重下降>20%,体重指数(BMI)<20 kg/m2)、肥胖(BMI>35 kg/m2)、慢性肝病(有慢性病毒性肝炎、肝硬化和肝功能异常)、左心室射血分数<20%、透析和癌症活跃期患者。

 

我们使用稳定同位素示踪动力学(L-[环-2H5]苯丙氨酸)来测量白蛋白和纤维蛋白原的绝对合成速率(ASR)。如前所述,白蛋白和纤维蛋白原的ASR是在禁食12h后,从9:00到15:00h,6h连续输注L-[环-2H5]苯丙氨酸来测定的。负荷量L-[环2H5]苯丙氨酸4µmol/kg,然后以0.15µmol/kg/min输注6h。使用极低密度脂蛋白 (VLDL) 中快速翻转的肝脏合成蛋白载脂蛋白-B 100中稳态同位素富集来表示肝脏合成蛋白质的苯丙氨酸前体池的同位素富集。在初始和之后的每小时,抽取血液并立即转移到含有Na2EDTA和蛋白酶抑制剂-鸡尾酒的预冷试管中(Sigma Aldrich, Oakville, ON, Canada)。

 

为了分离纤维蛋白原,将乙醇/生理盐水(1:8)溶液加入血浆(4:1),在4°C孵育16h,然后在3000×g离心15min。将得到的纤维蛋白原颗粒溶解在不含β-2-巯基乙醇的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS PAGE)样品缓冲液中。含有可溶性白蛋白的上清液与SDS PAGE还原样品缓冲液1:1混合。纤维蛋白原和白蛋白分别用8%SDS PAGE在MINI-PROTEAN II系统(Bio-Rad LaboratoryHercules,CA,USA)上纯化。纤维蛋白原和白蛋白样品以及纯标准品和分子量将标记物加载到凝胶上,并在200V下分别运行180分钟和45分钟。用阳离子交换层析(Dowex-50W-X8,Bio Rad Laboratory,Hercules,CA,USA)从凝胶中分离出合适的蛋白条带,在110°C的6mol/L盐酸中水解16h。以正丙醇和乙酰氯为原料,将苯丙氨酸酯化,再经七氟丁酸酐衍生化得到七氟丁酰胺衍生物。苯丙氨酸示踪:示踪比用甲烷负化学电离气相色谱/质谱监测离子(383-388M/z)测定。

 

白蛋白和纤维蛋白原的分数合成率计算公式为:合成率分数(FSR)(%/d)=(Et2−Et1)·24·10 0/Efree·(Et2−Et1)。Et2−Et1是在输液的最后三小时(t2-t1) 示踪剂比率的增加:用线性回归线斜率测定输液最后3小时内白蛋白血浆池中苯丙氨酸的示踪比率,Efree是示踪剂: 稳态时肝脏游离苯丙氨酸的示踪比值。蛋白质的ASR用以下方法计算:ASR(mg/kg/d)=FSR·conc·PV。Conc是血浆中蛋白质的浓度,PV是根据输液期间测得的红细胞压积和70mL/kg体重的平均血容量计算出的血浆体积。

 

样本量的计算是基于以前的研究,该研究显示胆囊炎患者(136±38 mg/kg/d)和烧伤患者(111 mg/kg/d对53 mg/kg/d)的白蛋白ASR分别增加了30%到50%(分别为136±38 mg/kg/d和104±20 mg/kg/d)。假设40%的差异和先前记录的SD,每组中的14名受试者需要达到80%的功率水平,α误差为5%。连续资料分析采用非配对t检验或Mann-Whitney U检验,比例分析采用Fisher‘s精确检验。用简单回归分析血药浓度与合成的关系。双侧P值<0.05被认为具有统计学意义。使用Windows的GraphPad Prism版本8(GraphPad Software,San Diego, CA, USA)执行所有统计分析。

 

结果.03

 

14例非脓毒症患者和24例脓毒症患者(APACHE评分:21.7±7.8,SOFA评分:8.1±3.5)。脓毒症患者的详细情况如下:开胸心脏手术后并发症9例,呼吸相关的有12例(其中肺炎7例,I型呼吸衰竭3例,II型呼吸衰竭1例,急性呼吸窘迫综合征1例),药物滥用1例,转移性黑色素瘤1例,主动脉血栓形成1例。

 

患者特征如表1所示。脓毒症患者的平均血浆白蛋白浓度低于非脓毒症患者,而合成率具有可比性(表1)。与非脓毒症患者相比,脓毒症患者的平均血浆纤维蛋白原和纤维蛋白原合成率增加(表1)。脓毒症患者白蛋白/纤维蛋白原合成率低于非脓毒症患者(表1)。在非脓毒症患者中,血浆白蛋白和ASR之间没有统计学意义的相关性(图1A)。但血浆纤维蛋白原与ASR显著相关(图2A)。在脓毒症患者中,血浆白蛋白和纤维蛋白原均与ASR显著相关(图1B、2B)。原始源数据集可在附加文件1:表1中获得。

 

 

 

 

讨论.04

 

这是描述脓毒症患者白蛋白和纤维蛋白原循环系统浓度与其各自合成速率之间关系的首个报道。这项研究的结果表明,血浆中这两种蛋白的水平与它们的ASR相关。脓毒症期间的低蛋白血症很可能是外周清除率增加的结果,而不是合成障碍的结果,而高纤维蛋白原血症是由刺激产生引起的。在脓毒症患者中,纤维蛋白原ASR是非脓毒症患者的三倍多,而白蛋白合成速率与非脓毒症患者相当。

 

蛋白质营养不良时的低蛋白血症可归因于缺乏氨基酸导致肝脏白蛋白合成受损。相比之下,胆囊炎、脓毒症和烧伤时的低白蛋白水平与合成增加有关,这表明在这些条件下,白蛋白的产生不能补偿其流出增加,可能是通过毛细血管渗漏进入血管外间隙或排泄。

 

在目前的方案中,脓毒症患者也不能增加白蛋白的产生以维持正常的白蛋白血浆水平。在动物模型或腹腔脓肿患者中观察到的皮质醇和内毒素水平升高对白蛋白合成的抑制作用可能是导致这一发现的原因之一。对健康志愿者的研究表明,服用少量内毒素会增加白蛋白的产生,这表明内毒素的剂量可能也与代谢有关。

 

通过动员肝脏和其他组织中的多不饱和脂肪酸,从而促进细胞保护性脂质和自由基抑制物(如脂氧素、溶血素和保护素)的形成,白蛋白已被证明具有潜在的临床益处的抗炎作用。考虑到身体营养状态对白蛋白代谢的重要性,充足的能量和底物供应在免疫学上变得相关,特别是在脓毒症患者。结直肠癌手术后给予包含等氮量氨基酸的围手术期低卡营养的(患者)白蛋白合成增加,而肠外氨基酸摄入没有增加脓毒症患者的白蛋白合成。

 

本研究结果表明,脓毒症时纤维蛋白原血浆浓度与合成显著相关,脓毒症时高纤维蛋白原血症是纤维蛋白原合成增加的结果。脓毒症患者白蛋白ASR与纤维蛋白原ASR比值显著降低,表明肝脏蛋白质代谢转向以合成促炎蛋白为主,进一步强调了纤维蛋白原作为一种正急性时相蛋白的作用。

 

考虑到这种前体对纤维蛋白凝胶生成的关键作用,纤维蛋白原水平升高可能至少部分是炎症状态下观察到的凝血障碍和内皮损伤的原因。相反,药物抑制纤溶,例如使用氨甲环酸,已被证明可以减少开胸心脏手术和体外循环的炎症反应。

 

我们承认这项研究的几个局限性。

 

首先,冠状动脉疾病本身可能与炎症和代谢改变有关,这些改变可能影响了我们的结果。因此,择期冠状动脉旁路移植术的对照组受试者并不能代表健康受试者。其次,脓毒症患者通常表现出血浆容量的个体间差异。因此,本研究中用来计算ASR的简单公式对于计算这一患者群体的血浆容量可能并不完全准确。第三,未直接测定白蛋白清除率。因此,我们不能排除脓毒症时导致低蛋白血症的可能是分布体积的改变,而不是血管外间隙溢出的增加。第四,考虑到皮质醇和内毒素对白蛋白和纤维蛋白原合成的潜在影响,对这两种化合物的测量将有助于更好地描述患者特征,并可能提供有关所观察到的变化潜在机制的信息。

 

结论

 

脓毒症患者血浆白蛋白水平低于非脓毒症患者,但两组白蛋白合成情况相似,提示低蛋白血症不是由肝功能抑制引起的,而是循环清除率增强的结果。脓毒症时的高纤维蛋白原血症是纤维蛋白原合成增加的结果。进一步的研究是有必要的,以研究白蛋白的合成是否可以通过营养支持或其他药理干预进行改变。

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